Nghiên cứu tác dụng của nano bạc và nano đồng trong khử trùng mẫu, khử trùng môi trường nuôi cấy và vi nhân giống một số cây..

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu tác dụng của nano bạc và nano đồng trong khử trùng mẫu, khử trùng môi trường nuôi cấy và vi nhân giống một số cây..

1. BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Huỳnh Gia Bảo NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA NANO BẠC VÀ NANO ĐỒNG TRONG KHỬ TRÙNG MẪU, KHỬ TRÙNG MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ VI NHÂN GIỐNG MỘT SỐ CÂY TRỒNG CÓ GIÁ TRỊ KINH TẾ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số: 9 42 02 01 HÀ NỘI – 2023
2. Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. Người hướng dẫn 1: TS. Hoàng Thanh Tùng 2. Người hướng dẫn 2: GS.TS. Dương Tấn Nhựt Phản biện 1: PGS.TS. Phạm Văn Hiền Phản biện 2: PGS.TS. Phạm Bích Ngọc Phản biện 3: PGS.TS. Quách Ngô Diễm Phương Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ , ngày tháng năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
3. 1 MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô hay vi nhân giống được sử dụng rất rộng rãi để nhân giống các loài cây trồng khác nhau (cây hoa, cây rau, cây cảnh, ) và là công cụ hữu ích được sử dụng trong nghiên cứu sinh trưởng, sinh lý – sinh hóa của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô có thể sử dụng để sản xuất số lượng lớn cây giống sạch bệnh trong thời gian ngắn và sản xuất sinh khối chứa các chất có hoạt tính thứ cấp, Bên cạnh những thuận lợi mang lại thì kỹ thuật nuôi cấy mô vẫn còn một số hạn chế như nhiễm nấm, vi khuẩn, chúng sinh trưởng và làm hạn chế sự sinh trưởng của mô cấy do chúng sử dụng môi trường dinh dưỡng. Bên cạnh đó, môi trường nuôi cấy tối ưu hay lý tưởng cho sự sinh trưởng của mẫu cấy cần phải hấp khử trùng. Các bình nuôi cấy (túi nylon hay chai thủy tinh) chứa môi trường cũng cần được hấp khử trùng, môi trường được đun sôi; sau đó khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở nhiệt độ 121C với áp suất 15 psi trong khoảng thời gian từ 20 đến 40 phút. Ngoài ra, các bước chuẩn bị môi trường cần trải qua nhiều giai đoạn khác nhau và tốn nhiều công lao động, điện năng, thời gian, cho việc hấp khử trùng môi trường. Nano bạc (AgNPs) có tác dụng kháng các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, ) và được sử dụng trong nghiên cứu hay ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y dược, y sinh, Các nghiên cứu về tác động của AgNPs lên thực vật như khử trùng mẫu cấy, nảy mầm của một số cây trồng, sinh lý cũng như hình thái của thực vật cũng đã được chỉ ra. Tuy nhiên, ảnh hưởng của AgNPs lên khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy mô mà không hấp tiệt trùng vẫn chưa được công bố trước đây. Trong luận án này, AgNPs được bổ sung vào môi trường nuôi cấy (không hấp khử trùng) nhằm đánh giá khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy và cảm ứng sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy cây Cúc. Ngoài ra, những nghiên cứu trước đây chưa ghi nhận vai trò của nano đồng (CuNPs) trong giai đoạn khử trùng và cảm ứng của
4. 2 mẫu cấy; vì vậy, nghiên cứu này cũng đánh giá ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs trong giai đoạn khử trùng mẫu cấy và sinh trưởng tiếp theo, cảm ứng tạo phôi, trên cây Thu hải đường. Bên cạnh đó, vai trò của AgNPs lên khả năng sinh trưởng và các hiện tượng bất thường ở giai đoạn nhân nhanh chồi cây Tử linh lan cũng được chỉ ra trong luận án này. Đề tài “Nghiên cứu tác dụng của nano bạc và nano đồng trong khử trùng mẫu, khử trùng môi trường nuôi cấy và vi nhân giống một số cây trồng có giá trị kinh tế” hướng tới giải quyết một số vấn đề còn hạn chế của nuôi cấy mô. Đây là định hướng nghiên cứu chưa được quan tâm nhiều ở trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Kết quả của nghiên cứu sẽ góp phần đưa ra một hướng nghiên cứu mới trong vi nhân giống thực vật. Mục tiêu của đề tài Mục tiêu tổng quát Luận án được thực hiện nhằm đưa ra được giải pháp mới để khắc phục một số hạn chế đang gặp phải trong vi nhân giống như khử trùng môi trường nuôi cấy, khử trùng mẫu cấy, cải thiện sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy, khắc phục một số hiện tượng bất thường của cây Cúc, cây Thu hải đường và cây Tử linh lan nuôi cấy in vitro. Mục tiêu cụ thể Xác định hiệu quả của AgNPs lên khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy in vitro thay thế hấp tiệt trùng cũng như sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy cây Cúc. Xác định hiệu quả của AgNPs và CuNPs thay thế các chất khử trùng truyền thống như thủy ngân clorua (HgCl2) hay canxi hypochlorite (Ca(ClO)2) và ảnh hưởng của chúng lên sự sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy cây Thu hải đường. Xác định hiệu quả của AgNPs lên sự sinh trưởng và hạn chế một số hiện tượng bất thường trong giai đoạn tái sinh chồi cây Tử linh lan. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài Đối tượng nghiên cứu Ba loại cây trồng (Cúc, Thu hải đường và Tử linh lan) được sử dụng làm đối tượng nghiên cứu của luận án.
5. 3 Hai loại vật liệu nano (AgNPs và CuNPs) được sử dụng làm vật liệu để khử trùng mẫu cấy và môi trường hoặc bổ sung vào môi trường nuôi cấy in vitro. Phạm vi nghiên cứu Luận án đánh giá hiệu quả của AgNPs và CuNPs lên khả năng khử trùng môi trường nuôi cấy mô, mẫu cấy và khả năng sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy, các chỉ tiêu sinh lý - sinh hóa của cây Cúc, Thu hải đường và Tử linh lan nuôi cấy in vitro. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học Luận án này đã đánh giá được hiệu quả của AgNPs hoặc CuNPs lên khử trùng môi trường nuôi cấy mô thay thế hấp tiệt trùng, cảm ứng phát sinh hình thái, sinh trưởng tiếp theo và hạn chế một số hiện tượng bất thường trong nuôi cấy in vitro cây trong nuôi cấy cây Cúc, cây Tử linh lan và cây Thu hải đường. Ý nghĩa thực tiễn Luận án đã sử dụng AgNPs là chất khử trùng môi trường nuôi cấy mô thay thế chất khử trùng truyền thống và không ảnh hưởng đến sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy. Ngoài ra, AgNPs và CuNPs có thể sử dụng làm chất khử trùng mẫu cấy thay thế cho các chất khử trùng truyền thống và gia tăng sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy. Những đóng góp mới của luận án AgNPs bổ sung vào môi trường nuôi cấy được giảm một nửa hàm lượng agar có hiệu quả khử trùng môi trường nuôi cấy và không cần hấp tiệt trùng bằng nồi hấp. AgNPs và CuNPs có thể sử dụng làm tác nhân khử trùng mẫu cấy thay chất khử trùng truyền thống và cải thiện sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy. AgNPs gia tăng hiệu quả tái sinh chồi, giảm hiện tượng bất thường và giảm sự tích lũy ethylene, gia tăng hoạt tính enzyme chống oxy hóa của mẫu cấy nuôi cấy in vitro.
6. 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo và tổng kết về 6 vấn đề chính với các nội dung liên quan đến: (1) Khử trùng môi trường nuôi cấy in vitro; (2) Khử trùng mẫu cấy; (3) Nano bạc và ứng dụng; (4) Nano đồng và ứng dụng; (5) Hiện tượng bất thường trong vi nhân giống; (6) Tổng quan về các đối tượng nghiên cứu. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu thực vật Cây Cúc (Chrysanthemum morifolium) 4 tuần tuổi, Thu hải đường (Begonia tuberous) 8 tuần tuổi và Tử linh lan (Saintpaulia ionantha) 8 tuần tuổi với các bộ phận khác nhau được sử dụng làm vật liệu ban đầu cho các thí nghiệm. 2.1.2. Dung dịch nano kim loại AgNPs và CuNPs được tổng hợp bằng phương pháp hóa học với nồng độ ban đầu là 1.000 mg/L và sản xuất bởi Viện Công nghệ Môi trường (VAST, Hà Nội, Việt Nam). Dung dịch AgNPs có kích thước hạt khoảng 20 nm; trong khi đó, dung dịch CuNPs có kích thước hạt từ 20 đến 60 nm. 2.1.3. Hệ thống nuôi cấy Hệ thống nuôi cấy bình thủy tinh (AuM) là hệ thống đối chứng bao gồm bình thủy tinh thể tích 250 mL (AuM1) chứa 30 mL môi trường MS và bình thủy tinh thể tích 500 mL (AuM2) chứa 60 mL môi trường MS. Môi trường MS được bổ sung 30 g/L sucrose và 8 g/L agar. Hệ thống nuôi cấy AuM được hấp tiệt trùng. Hệ thống nuôi cấy hộp nhựa (NoM) bao gồm hộp nhựa hình vuông 5 L (kích thước miệng hộp: 21,5 cm × 21,5 cm; chiều cao hộp: 8,5 cm) (NoM1) chứa 250 mL môi trường và hộp nhựa hình chữ nhật 15 L (kích thước miệng hộp: 24,0 cm × 35,0 cm; kích thước đáy hộp: 22,5 cm × 33,0 cm; chiều cao hộp: 13,5 cm) (NoM2) chứa 500 mL môi trường MS bổ sung 30 g/L sucrose và agar (theo thí
7. 5 nghiệm ảnh hưởng của nồng độ agar tối ưu). Hệ thống nuôi cấy NoM được bổ sung AgNPs và không hấp tiệt trùng. 2.1.4. Thiết bị và dụng cụ 2.1.5. Điều kiện nuôi cấy 2.2. Nội dung nghiên cứu Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng mẫu cấy, môi trường nuôi cấy và vi nhân giống cây Cúc. Ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs lên khả năng khử trùng mẫu cấy và sinh trưởng tiếp theo của cây Thu hải đường. Ảnh hưởng của AgNPs lên khả năng tái sinh chồi và hạn chế một số hiện tượng bất thường trong nuôi cấy in vitro của cây Tử linh lan. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Bố trí thí nghiệm 2.3.1.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng mẫu cấy, môi trường nuôi cấy và vi nhân giống cây Cúc 2.3.1.2. Ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs lên khử trùng mẫu cấy và sinh trưởng tiếp theo của cây Thu hải đường 2.3.1.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên khả năng tái sinh chồi và hạn chế một số hiện tượng bất thường trong nuôi cấy in vitro của cây Tử linh lan 2.3.2. Xác định hàm lượng khí ethylene bằng phương pháp sắc ký khí 2.3.3. Xác định hoạt độ của enzyme kháng oxy hóa bằng phương pháp phân tích phổ tử ngoại 2.3.4. Xác định hàm lượng đường và tinh bột bằng phương pháp phân tích phổ tử ngoại 2.3.5. Giải phẫu hình thái 2.3.6. Xử lí số liệu 2.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
8. 6 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng môi trường nuôi cấy, khử trùng mẫu cấy và vi nhân giống cây cúc 3.1.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng môi trường nuôi cấy Hiệu quả của việc bổ sung AgNPs lên khử trùng môi trường nuôi cấy mô không hấp tiệt trùng được thu nhận ở Bảng 3.1.1. Do đó, môi trường MS0 bổ sung 4 mg/L AgNPs không hấp tiệt trùng bằng nồi hấp (Hình 3.1.1) có hiệu quả khử trùng môi trường nuôi cấy tương tự như môi trường được hấp khử trùng và được sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3.1.1. Ảnh hưởng của AgNPs lên khử trùng môi trường nuôi cấy MS0 không hấp khử trùng sau 1, 2, 3 và 4 tuần nuôi cấy. Tỷ lệ nhiễm của môi trường (%) Môi trường AgNPs Tuần thứ Tuần thứ Tuần thứ Tuần thứ MS0 (mg/L) nhất hai ba tư 0 33,33a* 76,67a 100,00a 100,00a 1 60,00b Không hấp tiệt 2 50,00c 73,33b 86,67b trùng 3 20,00d 60,00c 80,00b 4 - 5 - - - Hấp tiệt trùng 0 (Đối chứng) *Chữ cái khác nhau cùng một cột ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p <0,05 trong phép thử Duncan; Không ghi nhận tỷ lệ nhiễm 3.1.2. Khử trùng mẫu cấy bằng AgNPs và cảm ứng mô sẹo Các mẫu lá khử trùng với AgNPs ghi nhận cảm ứng mô sẹo nhanh hơn so với mẫu lá khử trùng với 1.000 mg/L HgCl2. Mô sẹo được cảm ứng khi mẫu lá khử trùng với AgNPs chỉ sau 2 tuần nuôi cấy so với 3 tuần đối với mẫu lá khử trùng bằng 1.000 mg/L HgCl2. Mẫu lá khử trùng với 250 mg/L AgNPs trong 15 và 20 phút ghi nhận tỷ lệ cảm ứng mô sẹo cao nhất (71,67% - 75,00%) so với những mẫu lá khử trùng bằng 1.000 mg/L HgCl2 (53,3%) sau 4 tuần (Hình 3.1.2).
9. 7 Hình 3.1.1. Môi trường nuôi cấy MS0 quan sát sau 4 tuần. A: Môi trường MS0 được khử trùng bằng nồi hấp tiệt trùng; B: Môi trường MS0 bổ sung 4 mg/L AgNPs và không hấp tiệt trùng. Mũi tên đơn: Môi trường màu trắng; Mũi tên kép: Môi trường hơi ngả vàng. Kết quả ghi nhận được cho thấy, tất cả mẫu lá rửa bằng nước cất đều bị nhiễm nấm và vi khuẩn sau 4 - 7 ngày nuôi cấy. Trong nghiên cứu này, môi trường nuôi cấy MS được phân lập và ghi nhận 1 loài vi khuẩn (Pseudomonas sp.) và 4 loài nấm (Aspergillus aculeatus, Fusarium sp., Penicillium sp. và Trichoderma sp.) dựa trên hình thái của tế bào (Bảng 3.1.2). Hình 3.1.2. Tỷ lệ cảm ứng mô sẹo của mẫu lá khử trùng bằng các chất khử trùng khác nhau sau 4 tuần. Bên cạnh đó, AgNPs ở nồng độ 125 mg/L và các thời gian từ 5 đến 15 phút, hay AgNPs ở nồng độ 500 mg/L với các thời gian từ 10 đến 30 phút thì không ghi nhận cảm ứng mô sẹo. Điều này có thể là
10. 8 do các mẫu cấy được khử trùng với AgNPs ở nồng độ thấp không cho hiệu quả khử trùng nấm và vi khuẩn hay nồng độ AgNPs quá cao lại gây độc và tổn thương mẫu cấy; do đó, mẫu cấy bị nhiễm hoặc hoại tử dẫn đến không thể cảm ứng mô sẹo (Hình 3.1.2). Bảng 3.1.2. Nấm và vi khuẩn gây nhiễm trên môi trường chứa mẫu cấy sau 1 tuần nuôi cấy. Đặc điểm của khuẩn TT Hình thái của tế bào Phân loại lạc Sợi nấm: dày và trắng, màu vàng cam xen giữa Sợi nấm: Phân nhánh, có màu hồng. Bào tử: màu vách ngăn. Cơ quan sinh hồng xanh (giữa), hơi 1 sản: Hình bàn chải cân Fusarium sp. hồng (trung tâm). Khuẩn đối và dày đặc. Bào tử: lạc: xanh lam (mặt trên), Hình elip đến hình cầu nâu hồng pha vàng nhạt (mặt dưới). Sợi: trắng Sợi nấm: Phân nhánh, Sợi nấm: dày, trắng vách ngăn. Cơ quan sinh 2 Aspergillus sp. Bào tử: đen sản: Hình cầu. Bào tử: Hình cầu Sợi nấm: Phân nhánh, Sợi nấm: mịn và trắng vách ngăn. Cơ quan sinh 3 Trichoderma sp. sữa. Bào tử: xanh lam sản: Phân nhánh. Bào tử: Hình cầu Sợi nấm: dày và màu Sợi nấm: Mỏng, nhiều trắng sữa, nhô ra màu 4 nhánh, có vách ngăn. Bào Penicillium sp. xanh lam có chia thùy tử: Hình elip (giữa) Khuẩn lạc: tròn, hồng, bề mặt nhẵn, bóng, bề Bào tử: Hình bầu dục. 5 mặt thạch lồi, viền đều. Pseudomonas sp. Gram + Kích thước khuẩn lạc: <1 mm 3.1.3. Tái sinh chồi trên môi trường bổ sung AgNPs không hấp tiệt trùng Tổng số chồi ghi nhận được khi mẫu mô sẹo nuôi cấy trên môi trường MS0 bổ sung 4 mg/L AgNPs (không hấp tiệt trùng) và môi trường MS0 không bổ sung AgNPs (hấp tiệt trùng) chứa 0,2 mg/L BA không có sự khác biệt rõ ràng sau 4 tuần. Tuy nhiên, các chỉ tiêu về sinh trưởng khác có sự khác biệt rõ ràng (Hình 3.1.3). Nghiên cứu
11. 9 này đã ghi nhận được mẫu lá nuôi cấy trên môi trưởng bổ sung 4 m/L AgNPs đã gia tăng hiệu quả cảm ứng mô sẹo và tái sinh chồi (Hình 3.1.2 và Bảng 3.1.3). Bảng 3.1.3. Tái sinh chồi trên môi trường MS0 có/không hấp tiệt trùng (bổ sung 4 mg/L AgNPs) sau 4 tuần nuôi cấy. Khối Tỷ lệ tái Số chồi/mẫu Chiều lượng Nghiệm thức sinh chồi cao chồi Tổng số 1 tươi (%) (cm) chồi cm cm (g) MS0 + 4 mg/L AgNPs + 0,2 mg/L 10,00a 3,67b 6,33a 1,50a 1,32a BA (không 100,00a* hấp tiệt trùng) MS0 + 0,2 mg/L BA (hấp 9,33ab 7,00a 2,33b 0,46b 1,16b tiệt trùng) MS0 (hấp tiệt - - - - - - trùng) * Chữ cái khác nhau cùng một cột ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p <0,05 trong phép thử Duncan; Không ghi nhận số liệu. Hình 3.1.3. Sự tái sinh chồi trên môi trường MS0 bổ sung/không bổ sung 4 mg/L AgNPs sau 4 tuần. A1, B1: Chồi thu nhận trên môi trường MS0 không bổ sung AgNPs, BA và hấp tiệt trùng; A2, B2: Chồi thu nhận trên môi trường MS0 chứa 0,2 mg/L BA và hấp tiệt trùng; A3, B3: Chồi thu nhận trên môi trường MS0 chứa 0,2 mg/L BA, 4 mg/L AgNPs và không hấp tiệt trùng. Thước đo: 1 cm.
12. 10 3.1.4. Ảnh hưởng của nồng độ agar lên sự sinh trưởng của cây con trong môi trường bổ sung AgNPs không hấp khử trùng Cây con thu nhận từ các chồi (1,5 cm) nuôi cấy trên môi trường MS0 bổ sung 4 mg/L AgNPs với hàm lượng agar khác nhau được thu nhận sau 4 tuần nuôi cấy (Bảng 3.1.4 và Hình 3.1.4). Bảng 3.1.4. Sinh trưởng của cây con trong môi trường MS0 chứa 4 mg/L AgNPs và nồng độ agar khác nhau (không hấp khử trùng) sau 4 tuần. Hàm Chiều Chiều Khối Chiều AgNPs lượng cao Số rộng Số lượng dài rễ SPAD (mg/L) agar cây lá/cây lá rễ/cây tươi (cm) (g/L) (cm) (cm) (g) 0x 8 4,33a* 8,33a 1,23ab 12,33a 2,57c 0,39a 36,53a 3 3,87bc 7,67ab 1,13bc 7,67c 3,83a 0,35ab 30,8c 4 4,11ab 7,67ab 1,30a 9,67b 3,23b 0,36ab 37,63a 5 4,17ab 6,67bc 1,33a 10,00b 2,40c 0,37ab 33,07b 4y 6 3,63cd 7,00bc 1,27ab 10,33b 2,36c 0,29c 32,7bc 7 3,47cd 6,67bc 1,23ab 8,33bc 2,23c 0,25c 34,3ab 8 3,00d 8,00ab 1,13bc 9,67bc 2,13c 0,27c 33,77ab * Chữ cái khác nhau cùng một cột ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p <0,05 trong phép thử Duncan; x: hấp khử trùng; y: không hấp khử trùng. Hình 3.1.4. Sự sinh trưởng của cây con trong môi trường MS0 bổ sung 4 mg/L AgNPs và nồng độ agar khác nhau (không hấp khử trùng) sau 4 tuần nuôi cấy. 0: Cây con trên môi trường MS0 bổ sung 8 g/L agar (không bổ sung AgNPs) được hấp tiệt trùng (đối chứng); 3, 4, 5, 6, 7, 8: Cây con ở nghiệm thức bổ sung hàm lượng agar khác nhau (3, 4, 5, 6, 7, 8 g/L; tương ứng), 4 mg/L AgNPs và không hấp tiệt trùng. Thước đo: 2 cm
13. 11 Trong các hàm lượng agar khác nhau (3 - 8 g/L), cây con thu nhận trên môi trường MS0 chứa 4 - 5 g/L agar cho sự sinh trưởng của của cây là cao hơn so với các hàm lượng agar khác (Bảng 3.1.4). 3.1.5. Nhân giống cây Cúc trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau Trong cả 3 hệ thống nuôi cấy, tất cả mẫu cấy đoạn thân đều ghi nhận tái sinh chồi (100%) sau 2 tuần nuôi cấy. Ngoài ra, các chỉ tiêu sinh trưởng như khối lượng tươi, chiều cao chồi và số lượng lá cũng không có sự khác biệt giữa 3 hệ thống nuôi cấy (dữ liệu không được hiển thị). Tuy nhiên, mẫu chồi ngọn ghi nhận khối lượng tươi, chiều cao cây, số rễ và SPAD trong hệ thống hộp nhựa NoM1 và NoM2 cao hơn so các chỉ tiêu này ở hệ thống nuôi cấy bình thủy tinh AuM2 sau 4 tuần nuôi cấy (Bảng 3.1.5; Hình 3.1.5), điều này cho thấy tác động tích cực của AgNPs lên sự sinh trưởng của cây Cúc ở giai đoạn ra rễ trong cả 3 hệ thống nuôi cấy. Hình 3.1.5. Sinh trưởng của chồi trong hệ thống NoM1 và NoM2. A: Đoạn thân nuôi cấy trong hệ thống hộp nhựa 5 L NoM1; B: Đoạn thân nuôi cấy trong hệ thống hộp nhựa 15 L NoM2; C: Chồi 1 tuần tuổi trong hệ thống hộp nhựa 5 L NoM1; D: Chồi 1 tuần tuổi trong hệ thống hộp nhựa 15 L NoM2; E: Chồi trong hệ thống hộp nhựa 5 L NoM1; F: Chồi nuôi cấy trong hệ thống hộp nhựa 15 L NoM2; G: Cây 2 tuần tuổi trong hệ thống hộp nhựa 5 L NoM1; H: Cây 2 tuần tuổi trong hệ thống hộp nhựa 15 L NoM2. Thước đo: A, C, E, G - 3 cm; B, D, F, H - 5 cm.
14. 12 Bảng 3.1.5. Sinh trưởng của cây Cúc trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy. Hệ thống nuôi cấy NoM1 NoM2 AuM2 Chỉ tiêu sinh trưởng Chiều cao cây (cm) 4,02a* 3,95a 3,76b Số lá/ cây 7,33a 7,20a 7,35a Chiều rộng lá (cm) 2,30a 2,27a 2,22a Số rễ/cây 13,17a 13,50a 11,33b Chiều dài rễ (cm) 2,88a 3,04a 2,45b Khối lượng tươi (g) 0,55a 0,52a 0,45b SPAD 38,45a 37,22a 34,37b Rễ 1,21a 1,38a 0,54b APX (U/g) Lá 1,53a 1,67a 0,44b Rễ 21,01a 24,27a 11,61b SOD (U/g) Lá 12,69a 13,32a 7,54b * Chữ cái khác nhau cùng một hàng ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p <0,05 trong phép thử Duncan. 3.1.6. Thích nghi và sinh trưởng tiếp theo ở giai đoạn vườn ươm Kết quả được thu nhận ở Bảng 3.1.6 và Hình 3.1.6 cho thấy chiều cao cây, số lá, chiều rộng lá, chiều dài lá và tỷ lệ sống sót của cây ở hệ thống nuôi cấy hộp nhựa NoM1 và NoM2 cao hơn so với các chỉ tiêu của cây con trong HTNC AuM2 sau 16 tuần trồng ở điều kiện vườn ươm. Cây con thu nhận từ hệ thống nuôi cấy hộp nhựa NoM1 và NoM2 ở vườn ươm sinh trưởng nhanh hơn. Ngoài ra, hoa bắt đầu nở sớm hơn một tuần so với hoa trong hệ thống bình thủy tinh 500 mL AuM2 (Bảng 3.1.6; Hình 3.1.6C). Sau 16 tuần trồng ở vườn ươm, cây con từ hệ thống hộp nhựa NoM1 và NoM2 bắt đầu nở hoa (Hình 3.1.6D). Bảng 3.1.6. Sự sinh trưởng của cây con có nguồn gốc từ các hệ thống khác nhau sau 16 tuần trồng ở điều kiện vườn ươm.
15. 13 Hệ thống nuôi cấy NoM1 NoM2 AuM2 Chỉ tiêu sinh trưởng Tỷ lệ sống sót (%) 100,00a* 100,00a 85,67b Chiều cao cây (cm) 14,71a 14,23a 12,38b Khối lượng tươi (g) 3,42a 3,67a 2,61b Số rễ/cây 18,33ab 20,67a 17,33ab Chiều dài rễ (cm) 6,97a 7,33a 6,87a Số lá/cây 14,33ab 14,67ab 12,33b Chiều dài lá (cm) 3,79a 3,93a 3,24b Chiều rộng lá (cm) 3,21ab 3,47a 2,97b Thời gian ra nụ (tuần) 12,21ab 12,47ab 13,14a Thời gian bung nụ (tuần) 14,68b 14,76b 15,53a Thời gian ra hoa (tuần) 16,13b 15,91b 17,01a * Chữ cái khác nhau cùng một hàng ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p <0,05 trong phép thử Duncan. Hình 3.1.6. Sự sinh trưởng và ra hoa của cây con thu nhận từ các hệ thống khác nhau ở điều kiện vườn ươm. A: Cây con in vitro 4 tuần tuổi; B, C, D: Cây thu nhận sau 4 tuần, 12 tuần và 16 tuần trồng ở vườn ươm và ra hoa (Hệ thống hộp nhựa 5 L NoM1, hộp nhựa 15 L NoM2 và bình thủy tinh 500 mL AuM2 từ trái sang phải; tương ứng). Thước đo: 2 cm. 3.1.7. Dự tính hiệu quả kinh tế của AgNPs lên khả năng khử trùng mẫu cấy, môi trường nuôi cấy và vi nhân giống cây Cúc Cây Cúc nuôi cấy mô bao gồm các giai đoạn khác nhau như khử trùng mẫu cấy, phát sinh hình thái và thích nghi ở vườn ươm. Hiện nay, các cơ sở nuôi cấy mô tại Lâm Đồng cho giá thành mỗi cây giống nuôi cấy mô dao động khoảng 500 - 1.000 đồng. Trong nghiên
16. 14 cứu này, ước lượng để sản xuất 10.000 cây giống Cúc nuôi cấy mô thì giá thành là khoảng 5 triệu đồng (Bảng 3.1.7). Bảng 3.1.7. Ước lượng chi phí sản xuất 10.000 cây giống Cúc. Đối chứng 4 mg/L AgNPs Hiệu quả Đơn giá Số Thành tiền Số Thành (đồng) (2) – (1) lượng (1) lượng tiền (2) I. Giai đoạn tái sinh Hệ số nhân chồi 2,33 6,33 (chồi/mẫu) (1) Môi trường MS 12.000 86 1.032.000 32 384.000 -648.000 (lít) (2) CĐHSTTV (mg) (a) NAA (0,5 73 43 3.139 16 1.168 -1.971 mg/L) (b) BA (2 2.057 172 353.804 64 131.648 -222.156 mg/L) (3) Năng lượng (kW) (a) Năng lượng cho nồi 2.200 25 55.000 0 0 -55.000 hấp (b) Năng lượng cho tủ 2.200 16 35.200 16 35.200 0 cấy (c) Năng lượng cho thắp sáng 1 2.200 121 266.200 121 266.200 0 bóng điện thắp 12h/ngày trong 28 ngày (4) AgNPs 200 0 0 128 25.600 25.600 (mL) (5) Agar (g) 400 688 275.200 128 51.200 -224.000 (6) Công lao 250.000 2,5 625.000 2,5 625.000 0 động II. Giai đoạn sinh trưởng
17. 15 (1) Môi trường MS 12.000 80 960.000 80 960.000 0 (lít) (2) CĐHSTTV (mg) (3) Năng lượng (kW) (a) Năng lượng cho nồi 2.200 25 55.000 0 0 -55.000 hấp (b) Năng lượng cho tủ 2.200 16 35.200 16 35.200 0 cấy (c) Năng lượng cho thắp sáng 1 2.200 121 266.200 121 266.200 0 bóng điện thắp 12h/ngày trong 28 ngày (4) AgNPs 200 0 0 320 64.000 64,000 (mL) (5) Agar (g) 400 640 256.000 320 128.000 -128.000 (6) Công lao 250.000 2,5 625.000 2,5 625.000 0 động Chi phí sản xuất 10.000 cây giống Cúc (chưa tính chi 4.842.943 3.598.416 -1.244.527 phí khấu hao thiết bị và tỉ lệ thất thoát do nhiễm) Chi phí trung bình cho 1 cây 484,29 359,84 -124,45 giống Ghi chú: Giá thành dựa trên giá hiện tại các công ty hóa chất cung cấp. 3.2. Ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs lên khả năng khử trùng mẫu cấy và sinh trưởng tiếp theo của cây thu hải đường 3.2.1. Ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs lên khử trùng mẫu cấy Tỷ lệ sống sót của 3 loại mẫu cấy (cuống lá, cuống hoa và đoạn thân) khử trùng bằng AgNPs, CuNPs, HgCl2 và Ca(ClO)2 được thu
18. 16 nhận sau 1 - 4 tuần nuôi cấy. Kết quả cho thấy rằng, tuỳ thuộc vào loại mẫu cấy và chất khử trùng được sử dụng thì tỷ lệ sống sót của mẫu cấy có sự khác biệt. Nhìn chung, 50 - 300 mg/L AgNPs ghi nhận hiệu quả khử trùng cao đối với cả 3 loại mẫu cấy. Những nồng độ AgNPs này cho thấy hiệu quả khử trùng mẫu cấy bằng hoặc cao hơn so với 1.000 mg/L HgCl2 hoặc 60.000 mg/L Ca(ClO)2 sau 4 tuần. Mặt khác, khi tăng nồng độ AgNPs lên 400 mg/L nhiều mẫu không bị nhiễm vi sinh nhưng mẫu chuyển sang màu nâu đen hoặc hoại tử. Do đó, tỷ lệ mẫu sống sót của mẫu cấy cuống lá (62,20%), cuống hoa (73,33%) và đoạn thân (73,33%) là thấp ở nồng độ cao của AgNPs. Đối với khử trùng mẫu cấy bằng CuNPs, nồng độ 50 - 200 mg/L CuNPs khử trùng mẫu cuống lá, nồng độ 200 - 300 mg/L CuNPs khử trùng mẫu cuống hoa và nồng độ 100 - 300 mg/L CuNPs khử trùng mẫu đoạn thân cho hiệu quả tương tự so với các nồng độ AgNPs tối ưu. 3.2.2. Ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs lên cảm ứng tạo phôi Khả năng cảm ứng tạo phôi của các mẫu cấy khử trùng với AgNPs, CuNPs, HgCl2 và Ca(ClO)2 có sự khác biệt sau 4 tuần (Bảng 3.2.1). Nhìn chung, tất cả các mẫu cấy khử trùng đều cảm ứng tạo phôi; trong đó, 200 - 300 mg/L AgNPs để khử trùng tất cả các mẫu cấy cho tỷ lệ cảm ứng tạo phôi cao hơn các nồng độ khác; trong đó, 200 ppm CuNPs cũng cho hiệu quả tương tự. Ngoài ra, phân tích bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử cho thấy trong mẫu cuống lá, đoạn thân và cuống hoa hàm lượng Cu được ghi nhận từ 0,10 - 0,18 mg/Kg. Sau khi khử trùng bằng dung dịch CuNPs, dư lượng Cu trong mẫu cuống lá, cuống hoa và đoạn thân gia tăng tỷ lệ thuận với nồng độ của CuNPs từ 0 đến 400 mg/L (Hình 3.2.1). Trong số 3 loại mẫu, dư lượng Cu trong mẫu đoạn thân và cuống lá cao hơn so với mẫu cuống hoa (Hình 3.2.1). Điều này cho thấy rằng các mẫu cấy khác nhau hấp thụ CuNPs khác nhau.
19. 17 Bảng 3.2.1. Ảnh hưởng của các chất khử trùng lên tỷ lệ cảm ứng tạo phôi từ các nguồn mẫu khác nhau sau 4 tuần. Chất khử Nồng độ Tỷ lệ phần trăm mẫu cấy cảm ứng tạo phôi (%) trùng (mg/L) Cuống lá Cuống hoa Đoạn thân 50 22,20bc 20,00bc 13,33e 100 37,80a 24,47b 22,20cd AgNPs 200 37,80a 40,00a 40,00a 300 35,53a 35,53a 42,20a 400 28,87b 20,00bc 28,87bc 50 31,13b 20,00bc 11,13e 100 35,53a 22,20bc 26,67bc CuNPs 200 40,00a 42,20a 46,67a 300 31,13b 40,00a 42,20a 400 28,87b 22,20bc 26,67bc HgCl2 1.000 17,80c 13,33c 20,00de Ca(ClO)2 60.000 22,20bc 22,20bc 31,13b * Chữ cái khác nhau cùng một cột ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p <0,05 trong phép thử Duncan. Hình 3.2.1. Dư lượng Cu trong mẫu cấy cây Thu hải đường sau khi khử trùng mẫu cấy với CuNPs. 3.2.3. Ảnh hưởng của AgNPs và CuNPs lên sinh trưởng của phôi soma Các hình dạng khác nhau của phôi soma có thu nhận từ mẫu cấy được khử trùng bằng AgNPs, CuNPs và HgCl2 được ghi nhận sau 8 tuần (Bảng 3.2.2). Sau tuần thứ nhất, các nghiệm thức đều hình thành
20. 18 phôi soma (100%). Tuy nhiên, có sự khác biệt về số lượng phôi soma ở từng loại mẫu cấy với các chất khử trùng mẫu cấy khác nhau (Bảng 3.2.2). Enzyme chống oxy hóa (CAT và APX) của các phôi thu nhận từ khử trùng mẫu cấy với HgCl2, AgNPs và CuNPs là không giống nhau sau 8 tuần (Bảng 3.2.3). Bảng 3.2.2. Sự phát sinh phôi soma của cây Thu hải đường thu nhận từ các chất khử trùng mẫu cấy khác nhau (AgNPs, CuNPs và HgCl2) sau 8 tuần. Chất Hình thái phôi soma Nguồn Tổng số khử Thủy Hai lá mẫu phôi Cầu Tim trùng lôi mầm HgCl2 29,33bc*x 8,67b 7,67b 6,33c 6,67c Cuống AgNPs 32,00b 8,33b 5,00d 7,67ab 9,00b lá CuNPs 33,00b 10,33a 6,00cd 8,00ab 8,67b HgCl2 29,33bc 7,67bc 9,67b 6,33c 5,67cd Cuống AgNPs 36,33a 4,33e 9,67a 8,00ab 14,33a hoa CuNPs 38,00a 5,33e 10,00a 8,67ab 14,00a HgCl2 30,67bc 10,33a 7,00bc 6,67bc 7,00c Đoạn AgNPs 34,33ab 6,33d 5,00d 10,67a 12,33a thân CuNPs 36,67a 7,00bc 4,67d 9,33ab 12,67a Ghi chú: * Chữ cái khác nhau cùng một cột ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p <0,05 trong phép thử Duncan; x Tổng số phôi là tổng số phôi ở tất cả các hình thái khác nhau (Cầu, tim, thủy lôi và hai lá mầm). Bảng 3.2.3. Hoạt tính enzyme chống oxy hóa (CAT và APX), hàm lượng tinh bột và đường của cụm phôi Thu hải đường sau 8 tuần nuôi cấy. Chất khử trùng HgCl2 AgNPs CuNPs Nguồn mẫu/ Chỉ tiêu CAT (U/g) 95,19b* 96,08b 100,06a APX (U/g) 0,40b 0,55a 0,58a Cuống lá Tinh bột (%) 33,24b* 36,11ab 39,26a Đường (mg/g) 75,98ab 68,45b 80,16a CAT (U/g) 100,12a 102,33a 104,86a Cuống hoa APX (U/g) 0,21c 0,50b 0,70a Tinh bột (%) 34,28b 38,23ab 40,87a
21. 19 Đường (mg/g) 90,24a 81,36b 70,09c CAT (U/g) 102,44b 94,97b 112,88a APX (U/g) 0,24c 0,45b 0,66a Đoạn thân Tinh bột (%) 37,24c 41,27b 45,58a Đường (mg/g) 90,24a 86,19ab 75,24b * Chữ cái khác nhau cùng một hàng ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p <0,05 trong phép thử Duncan. Hình 3.2.7. Phát sinh phôi soma thu nhận từ cảm ứng tạo phôi có nguồn gốc từ mẫu cấy cây Thu hải đường khử trùng bằng CuNPs. A, B, C: Phôi hình cầu; D, E, F: Phôi hình tim; G, H, I: Phôi hình thủy lôi; K, L, M: Phôi hai lá mầm; N, O, P: Cụm phôi soma thu nhận từ mẫu cuống lá, cuống hoa và đoạn thân (A - F, I: Thước đo 0,5 cm; G, H, K - P: Thước đo 1 cm).
22. 20 3.2.4. Tạo cây hoàn chỉnh và sinh trưởng tiếp theo ở điều kiện vườn ươm Con có nguồn gốc từ phôi soma phát triển tốt và không có bất thường về hình thái trong quá trình hình thành rễ (Bảng 3.2.4). Sau 16 tuần trồng ở vườn ươm, cây con ghi nhận tỷ lệ sống sót tốt và không có sự khác biệt đáng kể về sự sinh trưởng như chiều cao cây con và số lá trên cây con (Bảng 3.2.5). Bảng 3.2.4. Sinh trưởng của cây Thu hải đường in vitro tái sinh từ phôi soma sau 16 tuần nuôi cấy. Chiều Chiều Khối Khối Nghiệ Số Số cao cây dài rễ SPAD lượng lượng khô m thức rễ/cây lá/cây (cm) (cm) tươi (mg) (mg) HgCl2 9,83ab* 6,67b 6,00a 6,00a 43,72a 2019,55b 209,31c AgNPs 10,35a 8,00a 5,10a 6,00a 44,34a 2316,05ab 227,23b CuNPs 10,52a 7,67ab 5,21a 6,33a 46,89a 2395,13a 252,56a * Chữ cái khác nhau cùng một cột ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p <0,05 trong phép thử Duncan. Bảng 3.2.5. Thích nghi và sinh trưởng tiếp theo của cây Thu hải đường ở điều kiện vườn ươm sau 16 tuần. Thời Tỷ lệ Chiều Tỷ lệ ra Đường Nghiệ Số gian nở sống sót cao cây SPAD hoa kính hoa m thức lá/cây hoa (%) (cm) (%) (cm) (ngày) HgCl2 87,67ab* 21,83b 14,33ab 45,35c 92,67a 2,51b AgNPs 90,00a 23,15ab 13,67b 48,54b 100a 86,67b 2,70a CuNPs 90,33a 23,96a 15,00a 52,14a 85,33bc 2,68a * Chữ cái khác nhau cùng một cột ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p <0,05 trong phép thử Duncan. 3.3. Ảnh hưởng của AgNPs lên tái sinh chồi và hạn chế một số hiện tượng bất thường của cây Tử linh lan nuôi cấy in vitro 3.3.1. Đánh giá khả năng tái sinh chồi của các nguồn mẫu khác nhau và ghi nhận hiện tượng bất thường Kết quả ghi nhận được cho thấy, mẫu gân chính của lá ghi nhận sự tái sinh chồi tối ưu hơn so với mẫu lá nguyên với tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (66,00%), số chồi (5,33 chồi) và chiều cao chồi (0,73 cm) (Bảng 3.3.1). Vì vậy, việc sử dụng mẫu gân lá chính cho khả năng tái sinh chồi cao hơn so với mẫu lá nguyên. Một số hiện tượng bất
23. 21 thường trong giai đoạn tái sinh chồi của mẫu cấy chứa gân chính của lá và mẫu lá nguyên của cây Tử linh lan được ghi nhận ở Bảng 3.3.1. Bảng 3.3.1. Sự sinh trưởng và hiện tượng bất thường trong giai đoạn tái sinh chồi của cây Tử linh lan sau 8 tuần. Chỉ tiêu theo dõi Mẫu gân chính LSD0,05 Mẫu lá nguyên của lá Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%) 40,00 ± 1,15* 66,00 ± 2,08 9,96 Số chồi/mẫu 2,67 ± 0,33 5,33 ± 0,33 1,72 Chiều cao chồi (cm) 0,50 ± 0,60 0,73 ± 0,06 0,10 Thủy tinh thể (%) 20,00 ± 1,15 19,67 ± 1,20 Ns Mô sẹo ở mép lá (%) 21,67 ± 1,67 22,33 ± 1,45 Ns Hoại tử mẫu cấy (%) 14,67 ± 0,88 12,33 ± 1,45 0,50 Hóa nâu mẫu cấy và môi 20,33 ± 0,88 10,67 ± 0,67 4,43 trường nuôi cấy (%) *Các giá trị trong bảng thể hiện dữ liệu trung bình ± SE (sai số chuẩn) trong phép thử LSD với p < 0,05; Ns: Khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Ngoài ra, ở giai đoạn tái sinh chồi trên cả 2 mẫu lá nguyên và mẫu gân lá chính đều xuất hiện hiện tượng thủy tinh thể (20,00% và 19,67%; tương ứng), mô sẹo ở mép lá (21,67% và 22,33%; tương ứng), hoại tử mẫu cấy (14,67% và 12,33%; tương ứng), mẫu cấy và môi trường nuôi cấy hóa nâu (20,33% và 15,67%; tương ứng) (Bảng 3.3.1 và Hình 3.3.1). Trên cây Tử linh lan, hiện tượng bất thường ghi nhận ở giai đoạn tái sinh chồi là khoảng 20% trên cả 2 loại mẫu cấy (lá nguyên và gân chính của lá) với các đặc điểm như chồi và lá có hiện tượng mọng nước và biến dạng (Hình 3.3.1D-F). Trong nghiên cứu này, hiện tượng mô sẹo xuất hiện ở mép lá được ghi nhận trong nuôi cấy mô, đây có thể là do trong giai đoạn tái sinh chồi, các chồi được tạo thành có kích thước nhỏ và các lá nằm gần và tiếp xúc với môi trường nuôi cấy (môi trường MS chứa CĐHSTTV như BA và NAA); do đó, các mẫu lá hình thành mô sẹo (Hình 3.3.1G-I). 3.3.2. Ảnh hưởng của AgNPs gia tăng lên kết quả tái sinh chồi và khắc phục một số hiện tượng bất thường Sau 4 và 8 tuần nuôi cấy, AgNPs có hiệu quả lên sự tái sinh chồi, hạn chế một số hiện tượng bất thường, sự biến động khí ethylene, enzyme chống oxy hóa (Bảng 3.3.2, 3.3.3, 3.3.4 và Hình 3.3.2, 3.3.3).
24. 22 Hình 3.3.1. Một số hiện tượng bất thường trong giai đoạn tái sinh chồi của cây Tử linh lan sau 8 tuần nuôi cấy. A, B, C: Mẫu cấy sinh trưởng bình thường; D, E, F: Mẫu cấy thủy tinh thể; G, H, I: Mẫu cấy hình thành mô sẹo ở mép lá; K, L, M: Mẫu cấy và môi trường nuôi cấy hóa nâu (Thước đo: 1 cm; Ngoại trừ A: 0,5 cm - Mẫu cấy được chụp dưới kính hiển vi soi nổi ở độ phóng đại là 10x – trừ hình A và K). Bảng 3.3.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên sự tái sinh chồi và sinh trưởng của cụm chồi sau 4 tuần nuôi cấy. Tỷ lệ tái Chiều Khối lượng Khối lượng AgNPs Số sinh chồi cao chồi tươi cụm khô cụm (mg/L) chồi/mẫu (%) (cm) chồi (mg) chồi (mg) 0 67,67d* 5,67b 0,47bc 282,67c 36,00d 1 79,00bc 6,00b 0,53ab 467,67b 60,67b 2 89,33a 6,00b 0,67a 581,33a 72,67a 3 82,33b 7,67a 0,43bc 409,00b 50,33c 4 76,33c 5,00b 0,30c 409,33b 42,33cd * Chữ cái khác nhau cùng một cột ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p 1 cao chồi SPAD lượng lượng (mg/L) Tổng cm (cm) tươi (mg) khô (mg) 0 7,33bc* 1,67bc 0,73c 27,33a 1020,33d 120,00c 1 10,67a 2,33b 0,80bc 27,67a 1198,33c 134,33b
25. 23 2 10,00a 5,67a 1,30a 30,00a 1476,00a 160,67a 3 8,00b 1,33d 0,93b 28,00a 1358,00b 147,00ab 4 6,00c 1,00e 0,73c 25,33a 977,67d 110,67c * Chữ cái khác nhau cùng một cột ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p <0,05 trong phép thử Duncan. Hình 3.3.2. Ảnh hưởng của AgNPs lên khả năng tái sinh chồi cây Tử linh lan sau 4 và 8 tuần nuôi cấy. A: Cụm chồi sau 4 tuần nuôi cấy; B: Cụm chồi sau 8 tuần nuôi cấy; C: Hình thái chồi (Thước đo: 2 cm). Hình 3.3.3. Ảnh hưởng của 2 mg/L AgNPs lên một số hiện tượng bất thường trong giai đoạn tái sinh chồi cây Tử linh lan sau 8 tuần nuôi cấy. Bảng 3.3.4. Hàm lượng ethylene trong đĩa nuôi cấy và enzyme chống oxy hóa của cụm chồi trên môi trường có bổ sung AgNPs sau 8 tuần nuôi cấy. AgNPs (mg/L) Ethylene (mg/L) CAT (U/g) APX (U/g) 0 1,36ab 77,31e 0,29e 1 1,45a 82,32d 1,11b 2 1,15c 101,51a 2,37a 3 1,32bc 88,09b 0,94c 4 1,44a 86,90c 0,40d * Chữ cái khác nhau cùng một cột ghi nhận sự khác biệt với ý nghĩa thống kê p <0,05 trong phép thử Duncan.
26. 24 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận AgNPs khử trùng môi trường nuôi cấy mô: Bổ sung 4 mg/L AgNPs vào môi trường nuôi cấy và giảm một nửa hàm lượng agar (4 g/L) có hiệu quả khử trùng môi trường nuôi cấy và không cần hấp tiệt trùng. AgNPs và CuNPs khử trùng mẫu cấy và sinh trưởng tiếp theo của mẫu cấy: Mẫu lá cây Cúc được khử trùng với 250 mg/L AgNPs trong 15 -20 phút ghi nhận tỷ lệ cảm ứng mô sẹo tối ưu so với khử trùng mẫu cấy với 1.000 mg/L HgCl2. Trong khi đó, các nguồn mẫu cuống lá, cuống hoa và đoạn thân cây Thu hải đường khử trùng với 200 mg/L AgNPs hoặc CuNPs có hiệu quả khử trùng mẫu cấy và cảm ứng tạo phôi tối ưu so với các chất khử trùng khác. Ngoài ra, số lượng phôi soma và số phôi soma có hình dạng hai lá mầm cao nhất được thu nhận với khử trùng mẫu cấy có nguồn gốc khử trùng bằng AgNPs hoặc CuNPs cũng như gia tăng hoạt tính emzyme chống oxy hóa CAT và APX. AgNPs trong giai đoạn tái sinh chồi: Mẫu gân chính của lá cây Tử linh lan nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2 mg/L AgNPs ghi nhận gia tăng sự tái sinh chồi và sinh trưởng của cụm chồi; giảm hiện tượng thủy tinh thể, mô sẹo ở mép lá, hoại tử mẫu cấy, mẫu cấy và môi trường hóa nâu; giảm sự tích lũy ethylene và gia tăng hoạt tính emzyme chống oxy hóa CAT và APX. 4.2. Kiến nghị Nghiên cứu thêm vai trò của AgNPs và CuNPs trên nhiều cây trồng nuôi cấy mô khác. Nghiên cứu vai trò của CuNPs thay thế muối đồng trong môi trường nuôi cấy mô.
27. DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. H.T. Tung, H.G. Bao, D.M. Cuong, H.T.M. Ngan, V.T. Hien, V.Q. Luan, B.V.T. Vinh, H.T.N. Phuong, N.B. Nam, L.N. Trieu, N.K. Truong, P.N.D. Hoang, D.T. Nhut (2021) Silver nanoparticles as the sterilant in large-scale micropropagation of chrysanthemum. In Vitro Cell. Dev. Biol. - Plant 57: 897- 906.doi.org/10.1007/s11627-021-10163-7. 2. H.G. Bao, H.T. Tung, H.T. Van, L.T. Bien, H.D. Khai, N.T.N. Mai, V.Q. Luan, D.M. Cuong, N.B. Nam, B.V.T. Vinh, D.T. Nhut (2022) Copper nanoparticles enhanced surface disinfection, induction and maturation of somatic embryos in Tuberous begonias (Begonia × tuberhybrida Voss) cultured in vitro. Plant Cell Tiss. Org Cult. 3. H.T. Tung, H.G. Bao, Ngo Quoc Buu, Nguyen Hoai Chau, D.T. Nhut (2022) The use of silver nanoparticles as a disinfectant and media additive in plant micropropagation. In: D.T. Nhut, H.T. Tung, E.C. Yeung (Eds.), Plant tissue culture: New techniques and application in horticultural species of tropical region. Springer, Singapore. 4. H.T. Tung, H.T. Van, H.G. Bao, L.T. Bien, H.D. Khai, V.Q. Luan, D.M. Cuong, T.H. Phong, D.T. Nhut (2021) Silver nanoparticles enhanced efficiency of explant surface disinfection and somatic embryogenesis in Begonia tuberous via thin cell layer culture. Tạp chí Công nghệ Sinh học 19(2): 337-347. 5. H.G. Bảo, H.T. Tùng, N.T.N. Mai, H.Đ. Khải, Đ.M. Cường, D.T. Nhựt (2022) Nano bạc gia tăng hiệu quả tái sinh chồi và hạn chế một số hiện tượng bất thường của cây African violet (Saintpaulia ionantha Wendl.) nuôi cấy in vitro. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nan (Bản B) – Chấp nhận đăng.