Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo

pdf 173 trang lethuy22 04/04/2025 80
Bạn đang xem 30 trang mẫu của tài liệu "Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo", để tải tài liệu gốc về máy hãy click vào nút Download ở trên.

File đính kèm:

  • pdfLuan an TS.pdf
  • pdfTom tat luan an.pdf
  • pdfTrich yeu luan an.pdf

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TIỀN TIẾN NAM NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH DỊCH HÓA, ĐƯỜNG HÓA VÀ LÊN MEN ETHANOL ĐỒNG THỜI Ở NỒNG ĐỘ CHẤT KHÔ CAO TỪ GẠO Ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 9540101 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Hà Nội - 2023
  2. Công trình được hoàn thành tại Đại học Bách khoa Hà Nội NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS. TS. CHU KỲ SƠN 2. TS. PHẠM TUẤN ANH Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Đại học Bách khoa Hà Nội, họp tại Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi giờ, ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1. Thư viện Tạ Quang Bửu – Đại học Bách khoa Hà Nội 2. Thư viện Quốc gia Việt Nam
  3. MỞ ĐẦU MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Ethanol (cồn) là sản phẩm có vai trò quan trọng trong nền kinh tế. Trong công nghiệp thực phẩm, các sản phẩm chứa cồn được sử dụng làm đồ uống có từ lâu đời và phổ biến trên thế giới. Trong công nghiệp cồn được dùng làm dung môi và nguyên liệu cho nhiều lĩnh vực như hóa chất, mỹ phẩm, sinh học, dược, chế biến và bảo quản nông sản thực phẩm Ngày nay, khi nhu cầu năng lượng thế giới tiếp tục tăng cao và các nguồn nhiên liệu truyền thống (dầu mỏ, than đá, khí đốt ) đang ngày càng cạn kiệt, nhiên liệu sinh học là giải pháp thay thế thích hợp. Trong đó, cồn là nhiên liệu thay thế quan trọng nhất và được sử dụng rộng rãi ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Nguyên liệu để sản xuất cồn là các nguyên liệu chứa đường (đường mía, rỉ đường, củ cải đường ), chứa tinh bột (củ, hạt, ngũ cốc), nguyên liệu chứa cellulose và nguyên liệu từ sinh khối tảo [1]. Công nghệ sản xuất và sản lượng cồn hiện nay chủ yếu sử dụng nguồn nguyên liệu chứa đường và tinh bột [1,2]. Trên thế giới nguyên liệu sản xuất cồn được sử dụng nhiều nhất là ngô, đường mía. Các nguyên liệu như cellulose và sinh khối tảo vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện [2,3]. Tại Việt Nam, nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thường được sử dụng trong sản xuất cồn thực phẩm là gạo. Đây là loại cây lương thực chính, là nguyên liệu chính để sản xuất rượu truyền thống và sản xuất cồn thực phẩm ở nước ta. Đây cũng là cây trồng chủ lực có sản lượng lớn của Việt Nam, và hàng năm nước ta là một trong ba nước có sản lượng gạo xuất khẩu cao nhất thế giới [4]. Do đó, trong nội dung nghiên cứu của luận án này chủ yếu đề cập đến công nghệ sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột, cụ thể là từ gạo tại Việt Nam. Công nghệ sản xuất cồn truyền thống từ nguyên liệu chứa tinh bột được thực hiện qua bốn giai đoạn: dịch hóa, đường hóa, lên men và chưng cất. Quá trình này bao gồm nhiều công đoạn và sử dụng nhiều thiết bị, năng lượng và tiêu tốn nhiều nước cho các công đoạn chính và các công đoạn trung gian (làm nguội) trong sản xuất [5]. Hiện nay, công nghệ đường hóa và lên men đồng thời (SSF) đang được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp sản xuất cồn. Trong công nghệ này quá trình hồ hóa và dịch hóa thường được thực hiện ở nhiệt độ trên 80oC, quá trình đường hóa và lên men đồng thời được thực hiện với tác dụng của các enzym thế hệ mới và nấm men đã giúp nâng cao hiệu suất lên men (HSLM), giảm chi 1
  4. phí sản xuất cồn [3,6,7]. Trong những năm gần đây, công nghệ sản xuất cồn tiết kiệm năng lượng không gia nhiệt đã được phát triển và nghiên cứu. Với việc sử dụng các enzym thế hệ mới, quá trình dịch hóa, đường hóa và lên men đồng thời được thực hiện ở điều kiện nhiệt độ thường trong cùng một thiết bị đã làm giảm bớt chi phí sử dụng tài nguyên (năng lượng, nước, thiết bị ), giảm chất thải (nước thải, khí CO2) ra môi trường và giảm giá thành sản phẩm [5,8]. Công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao hay còn gọi là quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men đồng thời ở nồng độ chất khô cao để sản xuất cồn (SLSF- VHG) cũng đã được tập trung nghiên cứu do những ưu điểm về năng suất, tiết kiệm năng lượng, giảm chi phí đầu tư thiết bị và giảm thành phần chất thải [8]. Tuy nhiên, đây là công nghệ mới phát triển trong thời gian gần đây nên còn ít nghiên cứu hoàn thiện công nghệ trên các loại nguyên liệu khác nhau, chưa có nhiều ứng dụng công nghệ này ở các quy mô pilot và quy mô công nghiệp. Việc ứng dụng công nghệ SLSF-VHG từ gạo còn một số tồn tại như sau: chưa tối ưu nguyên liệu, enzym, chất bổ sung (nguồn nitơ); Hiệu suất lên men còn thấp, thời gian lên men còn dài, cơ chế biến đổi thành phần dịch lên men, cơ chế tấn công của enzym vào nguyên liệu bột gạo sống chưa được giải thích đầy đủ; Chưa có thống kê năng lượng, đánh giá hiệu quả và chi phí sản xuất của quy trình ở quy mô sản xuất nhỏ. Xuất phát từ những vấn đề thực tế trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu xác định nguyên liệu, các thông số công nghệ và giải thích cơ chế thủy phân lên men bột gạo sống trong quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men đồng thời ở nồng độ chất khô cao. Phát triển ứng dụng quy trình dịch hóa, đường hóa và lên men đồng thời ở nồng độ chất khô cao ở quy mô pilot. Nghiên cứu ứng dụng chưng cất chân không tách cồn đồng thời để nâng cao hiệu suất, rút ngắn thời gian lên men và nâng cao nồng độ chất khô trong quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao từ gạo. 3. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Lựa chọn loại gạo, enzym, nấm men cho quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao. Nội dung 2: Nghiên cứu điều kiện công nghệ, động học và cơ chế biến đổi thành phần dịch lên men trong quy trình SLSF-VHG. 2
  5. Nội dung 3: Nghiên cứu ứng dụng quy trình SLSF-VHG để sản xuất cồn ở quy mô 100 L dịch lên men. Nội dung 4: Nghiên cứu lên men và chưng cất chân không tách cồn đồng thời trong quy trình SLSF-VHG. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Ý nghĩa khoa học Nghiên cứu đã bổ sung kết quả để lựa chọn loại nguyên liệu (gạo, enzym, nấm men) phù hợp cho quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao tại Việt Nam. Luận án đã cung cấp những thông tin khoa học và giải thích khá đầy đủ về động học của quá trình dịch hóa, đường hóa và lên men ethanol trong quy trình SLSF-VHG dưới tác dụng của nhiều yếu tố mới: sử dụng hệ enzym thế hệ mới, nâng cao nồng độ cơ chất, phương thức lên men, phương thức giảm ức chế của sản phẩm cuối làm cơ sở khoa học cho cải tiến công nghệ lên men ethanol. Đánh giá hiệu quả việc sử dụng enzym protease trên cơ sở thủy phân protein trong nguyên liệu và khả năng thay thế hoàn toàn nitơ bổ sung bên ngoài. Đã phát triển giải pháp ứng dụng chưng cất chân không tách cồn để nâng cao nồng độ chất khô và rút ngắn thời gian lên men trong quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao. Ý nghĩa thực tiễn Xác lập được điều kiện công nghệ và thử nghiệm sản xuất cồn không gia nhiệt với nồng độ chất khô cao quy mô 100 L làm cơ sở phát triển quy trình và nâng cao hiệu quả sản xuất cồn từ gạo Việt Nam, tiết kiệm chi phí và giảm thiểu tác động môi trường. 5. Những đóng góp mới của luận án Nghiên cứu đã cho thấy loại gạo IR50404 và các loại gạo có hàm lượng amylose nhỏ hơn 26,32% là phù hợp nhất cho quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt, đây là cơ sở để lựa chọn nguyên liệu cho sản xuất cồn thực phẩm từ gạo tại Việt Nam. Luận án đã đề xuất các thông số công nghệ, giải thích được động học của quá trình lên men cồn, giải thích cơ chế hoạt động của tổ hợp enzym thế hệ mới thông qua công nghệ dịch hóa đường hóa và lên men đồng thời ở nồng độ chất khô cao từ gạo, làm cơ sở khoa học cho thiết lập cải tiến công nghệ trong lên men cồn từ gạo Việt Nam. Kết quả nghiên cứu 3
  6. của luận án cũng cho thấy ưu điểm nổi bật khi sử dụng enzym protease thay thế urea trong quy trình SLSF-VHG. Đã bước đầu ứng dụng quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao quy mô 100 L dịch lên men. Hiệu suất lên men 89,07%, nồng độ cồn trong dịch lên men 17,73%, tạo sản phẩm đảm bảo chất lượng và an toàn thực phẩm đáp ứng TCVN 7043:2013. Ứng dụng thành công chưng cất chân không tách cồn ở nồng độ chất khô 350 g/L đạt nồng độ cồn 19,98% v/v, hiệu suất lên men 89,09% và thời gian lên men 72 h, kết quả này nâng cao được nồng độ chất khô 12,6%, nồng độ cồn tăng 2,16% v/v, rút ngắn thời gian lên men 24 h so với quy trình SLSF-VHG tối ưu (ở nồng độ chất khô 310,8 g/L). Lần đầu tiên ứng dụng chưng cất chân không tách cồn nâng cao được nồng độ chất khô trong quy trình SLSF-VHG lên 500 g/L đạt hiệu suất và thời gian lên men tương đương với quá trình lên men ở nồng độ chất khô 310,8 g/L. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tình hình sản xuất cồn trên thế giới và Việt Nam Tình hình sản xuất cồn trên thế giới Tình hình sản xuất cồn ở Việt Nam Một số công nghệ sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột hiện nay Công nghệ sản xuất cồn không gia nhiệt Các nghiên cứu quy trình tích hợp không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao còn ít, một số nghiên cứu còn cho hiệu suất chưa cao, chưa có nghiên cứu về động học quá trình, chưa có nghiên cứu mô tả đầy đủ về cơ chế, hình thái hạt tinh bột khi bị thủy phân. Hình 1.3 Quy trình sản xuất cồn tiết kiệm năng lượng 4
  7. Nguyên liệu sản xuất cồn Nguồn cơ chất trong sản xuất cồn Nguyên liệu gạo trong sản xuất cồn 1.2.2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng gạo trong sản xuất cồn 1.2.2.2 Thành phần hóa học của gạo 1.2.2.3 Cấu tạo của tinh bột gạo Hình 1.5 Hình ảnh tinh bột gạo [73] 1.2.2.4 Cấu tạo của bột gạo Hình 1.6 Cấu tạo bột gạo [68,73] Enzym trong sản xuất cồn từ nguyên liệu chứa tinh bột Hình 1.9 Cấu tạo glucoamylase từ A. niger [96] 5
  8. Nấm men dùng trong công nghệ sản xuất cồn Các yếu tố công nghệ và cơ chế thủy phân nguyên liệu trong quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt nồng độ chất khô cao Ảnh hưởng của chế độ nghiền và kích thước nguyên liệu Ảnh hưởng của nồng độ enzym thủy phân nguyên liệu sống Cơ chế thủy phân của enzym trên nguyên liệu trong quy trình SLSF-VHG 1.3.3.1 Cơ chế thủy phân của enzym amylase đối với tinh bột Hình 1.11 Cơ chế thủy phân của enzym Stargen trên tinh bột ngô [32] Có hai dạng tấn công của enzym trên tinh bột điển hình là ăn mòn ngoại bề mặt và ăn mòn hướng tâm[116]. Rất ít và hầu như không có công bố giải thích cơ chế tấn công của enzym trên đối tượng bột nguyên liệu và tác động hiệp đồng của amylase và protease trong quy trình không gia nhiệt cụ thể là biến đổi hình thái và cấu trúc. 1.3.3.2 Ảnh hưởng của cấu trúc bột nguyên liệu Hình 1.12 Hình thái bột sắn bị thủy phân [162] 6
  9. Động học của quá trình sản xuất cồn không gia nhiệt Ảnh hưởng của nồng độ chất khô Ảnh hưởng của mật độ nấm men Ảnh hưởng của một số yếu tố công nghệ khác Tình hình ứng dụng quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt Ứng dụng chân không tách cồn đồng thời trong quá trình lên men NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu Gạo Bảng 2.1 Tổng hợp nguyên liệu gạo sử dụng cho nghiên cứu STT Tên gạo Độ ẩm (%) Đặc tính Nguồn gốc 1 OM5451 11,80±0,27 Dẻo mềm Tiền Giang 2 Bụi Sữa 11,82±0,19 Nở mềm Long An 3 IR 64 11,23±0,25 Dẻo mềm Long An 4 404 11,20±0,16 Nở xốp, mềm Tiền Giang 5 Hàm Châu 11,37±0,46 Nở xốp, cứng Tiền Giang Chế phẩm enzym Bảng 2.2 Thông số các enzym sử dụng trong nghiên cứu Nhà sản Nhiệt độ tối Enzym Tên thương mại Hoạt tính pH tối ưu xuất ưu (oC) Glucoamylase Stargen 002 Dupont 570 GAU/ga 4,0-4,5 20-40 và α-amylase Amigase Mega L DSM - 4,0-4,5 55-60 Distillase ASP Dupont 580 GAU/g 4,0-4,5 55-65 Glucoamylase GA-260 Angel 4,2-4,5 60-62 Spirizyme Novozymes - 4,0-5,0 30-35 Fermgen 2.5X Dupont 2500 4,0-5,0 28-35 Protease SAPU/gb Chế phẩm nấm men Bảng 2.3 Các chế phẩm nấm men sử dụng trong nghiên cứu Loại nấm men thương mại Thông số kỹ thuật Ethanol Red® Thermosacc® AS Nhà sản xuất Fermentis Lallemand Angel Yeast pH tối ưu 4,2-4,5 3,5-6,0 3,5-5,5 Nhiệt độ tối ưu (oC) 30-40 38 28-42 Mật độ tế bào (tb/g)* ≥ 2,0 ×1010 2 ×1010 2 ×1010 7
  10. Mật độ tb tt (tb/g) 3,8 ×1010 2,7 ×1010 2,9 ×1010 Tỉ lệ tế bào sống (%) 88,4 91,1 87,5 Chất bổ sung Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu Bố trí thí nghiệm 2.3.1.1 Nội dung 1: Lựa chọn loại gạo, nấm men, enzym cho quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm xác định loại gạo, enzym đường hóa phụ trợ, nấm men (i) Lựa chọn loại gạo (ii) Lựa chọn enzym đường hóa phụ trợ (iii) Lựa chọn chế phẩm nấm men 2.3.1.2 Nội dung 2: Nghiên cứu điều kiện công nghệ, động học và cơ chế biến đổi thành phần dịch lên men trong quy trình SLSF- VHG (i) Lựa chọn kích thước lưới nghiền gạo (ii) Ảnh hưởng của enzym dịch hóa, đường hóa chính 8
  11. (iii) Ảnh hưởng của nguồn nitơ (iv) Ảnh hưởng của nồng độ chất khô (v) Ảnh hưởng của nồng độ nấm men (vi) Động học của quá trình lên (vii) Biến đổi hình thái, cấu trúc bột gạo trong quá trình lên men 2.3.1.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ứng dụng quy trình SLSF-VHG để sản xuất cồn ở quy mô 100 L dịch lên men (i) Ứng dụng quy trình SLSF-VHG trên thiết bị tích hợp lên men chưng cất quy mô 100 L (ii) Đánh giá năng lượng, nước và chi phí sản xuất trên thiết bị tích hợp lên men chưng cất quy mô 100 L 2.3.1.4 Nội dung 4: Nghiên cứu lên men và chưng cất chân không tách cồn đồng thời trong quy trình SLSF-VHG (i) Ảnh hưởng của thời gian chưng cất chân không đến hiệu suất lên men (ii) Nghiên cứu kết hợp chưng cất chân không tách cồn để nâng cao nồng độ chất khô trong quy trình SLSF-VHG. Ống dẫn hơi Bể làm Áp kế P cồn-nước lạnh nước Van Ống Ống sinh sinh hàn Nước 1° Nước 1° hàn C C Dịch Bơm chân Bẫy lạnh lên không men Bể ổn nhiệt Cồn/nước Nước ngưng tụ Hình 2.2 Mô hình thí nghiệm lên men và chưng cất cân không tách cồn đồng thời [173] 9
  12. Phương pháp phân tích 2.3.2.1 Phương pháp hóa lý (1) Xác định độ ẩm theo phương pháp AOAC 930.04 (2000), tro AOAC 930.30 (2000), xơ thô AOAC 991.20 (2000), pH đo bằng máy pH (WTW inoLab® 9310, CHLB Đức) (2) Xác định hàm lượng tinh bột, đường tổng, đường khử bằng thuốc thử DNS (3) Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl (AOAC 2001.11) (4) Xác định protein hòa tan bằng phương pháp Bradford [168] (5) Xác định hàm lượng free amino nitrogen (FAN) bằng thuốc thử Ninhydrin [169] (6) Xác định hàm lượng amylose trong bột gạo, bã lên men [170] (7) Xác định nồng độ cồn bằng phương pháp chưng cất (8) Xác định hàm lượng của cồn, metanol, acid lactic, acid acetic, glycerol, glucose, maltose, maltotrisose bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Agilent 1290, Santa Clara, CA, USA) [27] với đầu dò RID (G1362A). 2.3.2.2 Phương pháp hóa sinh, vi sinh (1) Xác định hoạt độ enzym đường hóa (2) Xác định hoạt độ enzym protease (Dupont) (3) Xác định mật độ tế bào nấm men 2.3.2.3 Phương pháp vật lý (1) Biến đổi khối lượng dịch, thể tích, nồng độ chất khô, tinh bột sót (2) Quan sát hình thái bột gạo bằng kính hiển vi điện tử Scanning Electron Microscope (SEM) (3) Phân tích cấu trúc bột gạo bằng phổ XRD Phương pháp thống kê và xử lý số liệu thực nghiệm Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của ba thí nghiệm lặp lại. Phân tích thống kê kết quả thực nghiệm bằng phân tích phương sai (ANOVA) với mức khác biệt có ý nghĩa 95% (p ≤ 0,05) theo kiểm định Tukey. Phần mềm xử lý thống kê được sử dụng là Statgraphics Centurion 19 (Statgraphics Technologies, Inc. Plains, Virginia, USA). 10
  13. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Lựa chọn loại gạo, enzym, nấm men cho quy trình SLSF- VHG Lựa chọn gạo cho quy trình SLSF-VHG OM5451 Bụi Sữa IR 64 404 Hàm Châu 18 a a a a b a a a a a ab b b bc c a 16 abab ab b 14 12 Nồng độ cồn (% v/v) (% độ cồn Nồng 10 72 96 120 144 Thời gian (h) Hình 3.1 Nồng độ cồn theo loại gạo trong quy trình SLSF-VHG Gạo 404 là loại gạo phổ biến được trồng nhiều và có sản lượng lớn, hàm lượng tinh bột cao nhất, độ cồn đạt được và thời gian lên men tương đương so với hai loại gạo OM5451 và IR64, giá thành và chi phí sản xuất thấp nhất. Do đó nghiên cứu này lựa chọn gạo 404 làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo cho quy trình SLSF-VHG. Lựa chọn enzym đường hóa phụ trợ cho quy trình SLSF-VHG 3.1.2.1 Biến đổi đường tổng và nồng độ cồn 300 18 17 250 16 200 15 150 14 13 100 12 50 11 Nồng độ cồn (% v/v) (% độ cồn Nồng 0 10 0 24 48 72 96 120 Nồng độ đường tổng (g/L) tổng độ đường Nồng Đường tổng-AMLThời gian (h) Đường tổng-GA-260 Đường tổng-SC Đường tổng-DA Ethanol-AML Ethanol-GA-260 Hình 3.2 Ảnh hưởng enzym phụ trợ đến đường tổng, độ cồn 11
  14. Enzym Amigase® Mega L (AML) có hiệu quả cao nhất trong việc nâng cao độ cồn và hiệu suất lên men, do đó nghiên cứu này lựa chọn enzym đường hóa AML cho các nghiên cứu tiếp theo. Lựa chọn chế phẩm nấm men Nấm men Ethanol Red (ER) có nồng độ cồn và hiệu suất lên men cao nhất, có lượng cân cấp giống thấp hơn so với hai nấm men còn lại (0,92 g/L so với 1,28 và 1,20 g/L của TD và AS). Do đó lựa chọn Ethanol Red cho các nghiên cứu tiếp theo trong quy trình SLSF-VHG. 300 18 Đường tổng-ER 17 250 Đường tổng-TD 200 Đường tổng-AS 16 150 Ethanol-ER 15 100 Ethanol-TD 14 Ethanol-AS 50 13 v/v) (% độ cồn Nồng 0 12 Nồng độ đường tổng (g/L) tổng độ đường Nồng 0 24 48 72 96 120 Thời gian (h) Hình 3.3 Biến đổi độ cồn và đường tổng (a), đường khử (b) theo loại nấm men 600 500 400 ) 6 300 10 ER 200 TD 100 AS Nồng độ tế bào (CFU/ml x (CFU/ml bào tế độ Nồng 0 0 24 48 72 96 120 Thời gian (h) Hình 3.4 Đường cong sinh trưởng của nấm men ER, TD và AS 12
  15. Nghiên cứu điều kiện công nghệ, động học và cơ chế biến đổi thành phần dịch lên men trong quy trình SLSF-VHG Lựa chọn kích thước lưới nghiền bột gạo 3.2.1.1 Kết quả phân tích kích thước hạt của bột gạo qua lưới nghiền 110 100 90 80 70 60 0,3 mm 50 0,5 mm 40 1,0 mm 30 1,5 mm 20 2,0 mm 10 0 0,125 0,25 0,5 1 2 Tỉ lệ hạt lọt qua sàng (%) (%) sàng lọt qua hạt Tỉ lệ Kích thước lỗ sàng (mm) Hình 3.6 Phân bố kích thước hạt theo kích thước lưới máy nghiền Lưới nghiền 1,0 mm có phân bố kích thước hạt bột gạo khác biệt so với các kích lưới nghiền còn lại. Có 36,18% hạt lọt qua rây 0,125 mm, 59,08% hạt lọt qua rây 0,25 mm và 83,71% hạt lọt qua rây có kích thước 0,5 mm. 3.2.1.2 Biến đổi nồng độ cồn theo kích thước lưới nghiền 19 0,3mm 0,5mm 1,0mm 1,5mm 2,0mm 18 a a a b 17 a a a c b b 16 a a a b c 15 14 13 Nồng độ cồn (% v/v) (% độ cồn Nồng 12 72 96 120 Thời gian (h) Hình 3.7 So sánh nồng độ cồn theo kích thước hạt Nghiền gạo qua lưới 1,0 mm cho độ cồn trong dịch lên men tương đương nhưng có thời gian nghiền và công suất tiêu thụ điện thấp hơn đáng kể so với lưới 0,3 và 0,5 mm. Vì thế nghiên cứu này chọn kích thước lưới nghiền là 1,0 mm cho những nghiên cứu tiếp theo. 13
  16. Ảnh hưởng của nồng độ enzym đường hóa chính (Stargen 002) 300 250 15 200 10 150 100 5 50 0 0 Nồng độ cồn (% v/v) (% độ cồn Nồng Nồng đường tổng (g/L) tổng đường Nồng 0 24 48 72 96 120 Thời gian (h) Đường tổng-1,130 GAU/g RF Đường tổng-1,506 GAU/g RF Đường tổng-2,259 GAU/g RF Đường tổng-3,012 GAU/g RF Độ cồn-1,130 GAU/g RF Độ cồn-1,506 GAU/g RF Hình 3.8 Biến đổi đường tổng-độ cồn (a), đường khử (b) theo nồng độ enzym StargenTM 002 Ở các mức nồng độ 1,506 GAU/g RF được chọn là nồng độ thích hợp cho quy trình SLSF-VHG từ gạo và nồng độ này được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Ảnh hưởng nguồn nitơ 3.2.3.1 Ảnh hưởng của urea và protease đến đường tổng, đường khử và nồng độ cồn 400 20 (a) 200 10 Nồng dộ cồn (% v/v) (% cồn dộ Nồng 0 0 0 24 48 72 96 120 144 Nồng độ đường tổng (g/L) tổng đường độ Nồng Thời gian (h) R-đường tổng U-đường tổng P-đường tổng UP-đường tổng R-nồng độ cồn U-nồng độ cồn 14
  17. Hình 3.9 Ảnh hưởng urea và protease đến độ cồn - đường tổng (a), đường khử (b) 3.2.3.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến thành phần protein hòa tan, FAN hòa tan 3.2.3.3 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến sản phẩm phụ trong SLSF-VHG 3.2.3.4 Ảnh hưởng của urea và protease đến nấm men 3.2.3.5 Ảnh hưởng của protease và urea đến hình thái bột gạo Hình 3.12 Ảnh SEM của bột gạo ở 24 h lên men (a)-R, (b)-U, (c)-P và (d)-UP 3.2.3.6 Ảnh hưởng protease và urea đến biến đổi cấu trúc bột gạo 15
  18. 8000 0h 4000 24h (a) 24h (b) 72h 6000 72h 3000 96h 96h 120h 4000 2000 Cường độ Cường Cường độ Cường 2000 1000 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 5 10 15 20 25 30 35 40 2θo 2θo 4000 24h 6000 (c) 24h 72h (d) 72h 3000 96h 96h 120h 4000 120h 2000 Cường độ Cường Cường độ Cường 1000 2000 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 5 10 15 20 25 30 35 40 2θo 2θo Hình 3.14 Biến đổi cấu trúc bột gạo qua phổ XRD. (a)-R, (b)-U, (c)-P, (d)-UP 3.2.3.7 Ảnh hưởng của nồng độ protease đến hiệu suất lên men Bảng 3.8 Ảnh hưởng nồng độ protease đến độ cồn và hiệu suất lên men Lượng Fermgen 2.5X Nồng độ cồn 120 h (% Hiệu suất lên (SAPU/kg RF) v/v) men 120 h (%) 300 17,15±0,14b 86,17±0,48b 600 17,96±0,17a 90,29±0,69a 900 17,89±0,22a 89,89±1,02a 1200 17,92±0,20a 90,03±1,01a 1500 17,76±0,25a 89,26±1,26a Nồng độ 600 SAPU/kg RF là nồng độ tối ưu của enzym Fermgen 2.5X cho quy trình SLSF-VHG từ nguyên liệu bột gạo và nồng độ này được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. 16
  19. Ảnh hưởng của nồng độ chất khô Bảng 3.9 Ảnh hưởng nồng độ chất khô đến độ cồn và hiệu suất lên men theo thời gian Nồng độ Nồng độ cồn (% v/v) theo thời gian lên HSLM 120 chất khô men (h) h (%) (g/L) 96 120 144 310,8 17,71±0,42aA 17,77±0,09cA 17,82±0,04cA 89,23±0,46a 325 17,89±0,24aB 18,26±0,09bA 18,31±0,11bA 87,68±0,44b 350 17,93±0,22aB 18,52±0,18aA 18,76±0,16aA 82,58±0,80c Kết luận: nồng độ chất khô 325 và 350 g/L với cho hiệu suất lên men thấp và thời gian lên men kéo dài (120 h). Vì thế nồng độ chất khô 310,8 g/L (quy trình P mục 3.2.3) là nồng độ chất khô tối ưu nhất cho quy trình SLSF-VHG từ bột gạo với hiệu suất lên men cao (90,29%, thời gian lên men 96 h). Ảnh hưởng của mật độ nấm men 19 a a a a 18 b a 17 a a a b 16 c 15 14 b Nồng độ cồn (% v/v) (% độ cồn Nồng 13 12 72 96 120 Thời gian (h) 1,75E+07 tb/ml 3,50E+07 tb/ml Hình 3.16 Nồng độ cồn theo mật độ nấm men Kết luận: nồng độ cồn và đường tổng của tỉ lệ cấp giống 1X; 1,5X và 2X là tương đương nhau (mặc dù mức 2X cho độ cồn cao nhất). Mặt khác chi phí nấm men khá cao trong khi sử dụng với lượng 1,5X và 2X không làm tăng đáng kể độ cồn. Vì vậy nồng độ nấm men cấp giống ban 17
  20. đầu 1X (tương đương 0,92 g/L) là tối ưu cho quy trình SLSF-VHG từ gạo. Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất cồn SLSF-VHG ở quy mô phòng thí nghiệm (1 L dịch lên men) Như vậy trong nội dung này, luận án đã lựa chọn và hoàn thiện các thống số công nghệ của quy trình SLSF-VHG từ nguyên liệu gạo với các thông số được thống kê trong Hình 3.20 và Bảng 3.12 như sau: Gạo (404) + Nước (>310,8 g CK/L) Chỉnh pH (4,5) Stargen002 (Ethanol Red) 7 Dịch hóa, (1506 GAU/kg RF) 3,5 × 10 tb/mL Đường hóa và Lên men Fermgen 2.5X Đồng thời (600 SAPU/kg RF) 30°C, 96 h KH PO (4,8 mM) Amigase Mega L 2 4 (0,035% w/w) Chưng cất Bã Cồn Hình 3.17 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất cồn SLSF-VHG ở quy mô 1 L dịch lên men Bảng 3.11 Thông số tối ưu quy trình SLSF-VHG Thông số Giá trị Ghi chú Nhiệt độ lên men 30oC pH ban đầu 4,5 Dùng H2SO4 10% Chế độ khuấy trộn Liên tục 24 h đầu lên men 50 vòng/phút Nguyên liệu Gạo 404 18
  21. Nồng độ chất khô 310,8 g/L Kích thước lưới nghiền 1,0 mm Amygase Mega L 0,035% w/w 0,3 mL/kg RF StargenTM 002 1,506 GAU/g RF 2,29 g/kg RF Fermgen 2.5X 0,6 SAPU/g RF 0,24 g/kg RF Nấm men Ethanol Red 3,5 × 107 tb/mL 0,92 g/L KH2PO4 4,8 mM 0,66 g/L Thời gian lên men 96 h Nồng độ cồn đạt được 17,82% v/v Hiệu suất lên men (96 h) 89,5% Động học của quá trình lên men không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao Theo kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình lên men không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao. Quy trình tối ưu được (mục 3.2.6) được sử dụng để đánh giá chỉ tiêu động học của quá trình lên men. 3.2.7.1 Biến đổi một số thông số vật lý hóa lý trong dịch lên men 3.2.7.2 Cơ chế thủy phân tinh bột trong quy trình SLSF-VHG 40 Maltosetriose 30 Maltose 20 Glucose 10 0 Nồng độ đường (g/L) độ đường Nồng 0 24 48 72 96 120 Thời gian (h) Hình 3.18 Biến đổi thành phần đường tan trong dịch lên men 19
  22. 3.2.7.3 Các thông số động học lên men ở quy trình SLSF-VHG Hình thái, cấu trúc bột gạo trong quy trình SLSF-VHG Hình 3.20 Ảnh SEM hình thái bột gạo ở các chế độ khác nhau Kết luận: protease có tác dụng hỗ trợ tách tinh bột ra khỏi mạng lưới protein-tinh bột, enzym đường hóa khoan lỗ trên bề mặt theo cả hai cách mở rộng và khoét sâu lỗ và mở rộng tấn công lan trên bề mặt tinh bột. Quan sát XRD cho thấy vùng kết tinh và vô định hình đều được tiếp cận và tấn công đồng thời, vùng vô định hình bị suy giảm nhiều hơn tương ứng với thành phần amylose giảm mạnh ở giai đoạn cuối lên men. Tốc độ tăng trưởng riêng tối đa µmax thấp do đặc thù của quy trình không gia nhiệt ở nồng độ VHG. Thời gian lên men vẫn còn dài (96 h) so với các quy trình lên men từ dịch đường và các quy trình truyền thống có gia nhiệt. 20
  23. Nghiên cứu ứng dụng quy trình SLSF-VHG để sản xuất cồn quy mô 100 L dịch lên men Nghiên cứu quy trình SLSF-VHG quy mô 100 L dịch lên men 3.3.1.1 Quá trình lên men 300 250 15 200 Đường tổng 10 150 Nồng độ cồn 100 5 50 0 0 v/v) (% độ cồn Nồng 0 24 48 72 96 120 Nồng đường tổng (g/L) tổng đường Nồng Thời gian (h) Hình 3.22 Biến đổi độ cồn, đường tổng đường khử quy mô 100L Thống kê điện, nước và chi phí sản xuất cồn quy mô 100 L Bảng 3.19 Tính chi phí sản xuất cồn trên thiết bị tích hợp SLSF-VHG quy mô 100 L Khối Đơn giá Thành tiền Thành phần lượng (VNĐ) (VNĐ) Gạo (kg) 35 9.500 332.500 Stargen 002 (kg) 0,08 188.000 15.040 Fermgen 2.5X (kg) 0,0088 700.000 6.160 Amygase Mega L (kg) 0,012 345.000 4.140 Nấm men (kg) 0,03 275.000 8.250 KH2PO4 (kg) 0,066 45.000 2.970 Acid citric (kg) 0,015 32.000 480 Điện (kWh) 39,7 1.864 74.001 Nước (m3) 2,66 11.000 29.260 Nhân công (ngày công) 0,88 300.000 264.000 Khấu hao thiết bị (ngày) 5 41.333 206.665 Tổng cộng chi phí sản xuất 943.466 * Lượng sản phẩm rượu quy về rượu 40% v/v 21
  24. Kết luận: Chất lượng rượu được kiểm soát tốt, quy trình đơn giản, ít nhân công vận hành là những lợi thế của thiết bị và quy trình so với các mô hình sản xuất rượu thủ công hiện nay ở Việt Nam. Ngoài ra việc ứng dụng mô hình có thể được xem xét sản xuất cồn thực phẩm ở các quy mô lớn hơn. Nghiên cứu lên men và chưng cất chân không tách cồn đồng thời trong quy trình SLSF-VHG Ảnh hưởng của thời gian chưng cất chân không đến hiệu suất lên men 20 10 SLSF-VHG SLSFD-VHG-30 Độ cồn, % v/v % cồn, Độ 0 SLSFD-VHG-60 0 24 48 72 96 120 144 Thời gian (h) Hình 3.24 Biến đổi nồng độ cồn theo thời gian áp chân không Nghiên cứu nâng cao nồng độ chất khô trong quy trình SLSF- VHG bằng chưng cất chân không Trong phần này, ứng dụng kết quả của quy trình SLSFD-VHG-60 với thời gian áp chân không là 60 phút ở các nồng độ chất khô rất cao 350, 400, 500 và 600 g/L từ bột gạo để đánh giá khả năng và hiệu quả của các quy trình này. 32 28 24 20 16 12 8 4 0 0 24 48 72 96 120 Nồng độ cồn (% v/v) (% độ cồn Nồng Thời gian (h) Cồn thực-350 g/L Cồn thực-400 g/L Cồn thực-500 g/L Cồn thực-600 g/L Cồn tổng-350 g/L Cồn tổng-400 g/L Cồn tổng-500 g/L Cồn tổng-600 g/L Hình 3.28 Độ cồn khi áp chân không ở các nồng độ chất khô 22
  25. Bảng 3.21 Hiệu suất, thời gian lên men theo nồng độ chất khô ở chế độ chân không Độ cồn 120 h Hiệu suất 120 Thời gian Chất khô (g/L) (% v/v) h (%) lên men (h) 350 19,98 ± 0,21d 89,09 ± 0,93a 72c 400 22,94 ± 0,03c 89,52 ± 0,13a 96b 500 29,0 ± 0,44b 90,53 ± 1,37a 96b 600 32,02 ± 0,57a 83,29 ± 1,47b 120a Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) của ba lần đo. Các ký hiệu (a, b, c, d) trên mỗi cột thể hiện sự khác biệt với mức ý nghĩa p < 0,05. Kết luận: Ứng dụng chưng cất chân không rút ngắn thời gian lên men 40% đối với nồng độ 350 g/L. Nghiên cứu đã lần đầu tiên ứng dụng kỹ thuật chân không để lên men ở nồng độ chất khô rất cao (500 g/L) đạt hiệu suất (90,53%) và thời gian lên men (96 h) tương đương với quy trình SLSF-VHG ở điều kiện tối ưu. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1. Luận án đã chọn lựa được loại gạo 404 (IR50404), chế phẩm nấm men thương mại Ethanol Red và enzym đường hóa phụ trợ Amigase Mega L làm cơ sở cho việc lựa chọn nguyên liệu trong quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao. Lựa chọn loại gạo có hàm lượng amylose dưới 26,32% thì phù hợp cho sản xuất cồn theo quy trình này. 2. Luận án đã xác định được điều kiện thích hợp cho quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao từ nguyên liệu gạo. Nhiệt độ lên men là 30°C, pH ban đầu 4,5, chế độ khuấy trộn liên tục 50 vòng/phút trong 24 h đầu lên men, enzym đường hóa phụ trợ 0,035% w/w và chất bổ sung KH2PO4 4,8 mM. Kích thước lưới nghiền gạo 1,0 mm, nồng độ enzym StargenTM 002 1.506 GAU/kg bột gạo, enzym protease (Fermgen 2.5X 600 SAPU/kg bột gạo), nồng độ chất khô 310,8 g/L, nồng độ nấm men khởi động là 3,5 × 107 CFU/mL. Quy trình thích hợp có thời gian kết thúc lên men là 96 h, nồng độ cồn đạt được 17,82% v/v, hiệu suất lên men là 89,54%. Kết quả nghiên cứu rút ngắn được thời gian lên men 24 h và tăng hiệu suất lên men 3,24% so với nghiên cứu đã công bố trước đó. Đã xác định được các thông số động học của quá trình lên men như các biến đổi các thông số vật lý hóa lý, thành phần đường, protein hòa tan, FAN, các sản phẩm phụ (glycerol, metanol, axit lactic, axit acetic, aldehyt, rượu bậc cao ). Luận án cũng đã lần đầu tiên giải thích được cơ 23
  26. chế thủy phân đồng thời của tổ hợp enzym amylase và protease trên bột gạo (so với các công bố trước đó chỉ trên đối tượng tinh bột). Kết quả của luận án cũng cho thấy hiệu quả của việc sử dụng enzym protease thủy phân protein trong bột gạo có tác dụng nâng cao hiệu suất và rút ngắn thời gian lên men, thay thế hoàn toàn nitơ bổ sung từ bên ngoài (urea). 3. Luận án đã thử nghiệm thành công quy trình SLSF-VHG ở quy mô 100 L dịch lên men. Nồng độ cồn trong dịch lên men đạt 17,73% v/v, hiệu suất lên men là 89,07% thời gian kết thúc lên men là 120 h. Sản phẩm chưng cất là 29,5 lít rượu nồng độ 52,3% v/v. Các chỉ tiêu rượu chưng cất hoàn toàn đáp ứng theo tiêu chuẩn TCVN 7043:2013 về rượu trắng chưng cất. Đã thống kê được năng lượng (điện), nước và tính chi phí sản xuất cho quy mô 100 L. Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng mô hình thiết bị và công nghệ để sản xuất rượu an toàn quy hộ gia đình và quy mô sản xuất nhỏ tại Việt Nam. 4. Luận án đã ứng dụng thành công quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt và chưng cất chân không tách cồn đồng thời. Nồng độ chất khô 350 g/L đạt nồng độ cồn 19,98% v/v, hiệu suất lên men 89,09% và thời gian lên men 72 h. Kết quả này có độ cồn cao hơn 2% v/v, hiệu suất cao hơn 7,5% và rút ngắn 48 h lên men so với quy trình không chưng cất chân không và tương đương với công nghệ sản xuất cồn có gia nhiệt hiện nay. Nghiên cứu đã lần đầu tiên nâng cao được nồng độ chất khô lên 500 g/L với quy trình chưng cất chân không. Nồng độ cồn tổng đạt được là 29,0% v/v, hiệu suất lên men đạt 90,53% và thời gian lên men là 96 h. Kết quả này cho thấy tiềm năng trong việc ứng dụng kỹ thuật chưng cất chân không tách cồn đồng thời trong quy trình SLSF-VHG để sản xuất cồn. Kiến nghị Cần nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của hiện tượng lắng bột gạo sống trong quá trình lên men để có phương án khuấy trộn phù hợp trước khi đưa ra sản xuất ở quy mô lớn. Triển khai quy trình SLSF-VHG ở quy mô thử nghiệm và sản xuất công nghiệp để đưa công nghệ vào thực tế, giúp tiết kiệm năng lượng, đơn giản hóa quy trình sản xuất, nhân công, chất thải: (i) triển khai ứng dụng thiết bị tích hợp trên quy mô hộ gia đình và sản xuất nhỏ để đảm bảo chất lượng và an toàn thực phẩm cho sản phẩm rượu. (ii) ứng dụng quy trình SLSF-VHG cho sản xuất cồn thực phẩm ở quy mô công nghiệp. (iii) thử nghiệm quy trình tích hợp sản xuất cồn không gia nhiệt và chưng cất chân không ở quy mô pilot. Nghiên cứu thu hồi và nâng cao giá trị gia tăng phụ phẩm của quy trình SLSF-VHG làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp thực phẩm đặc biệt là nguyên liệu giàu protein từ bã rượu gạo. 24
  27. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN [1] Yves Waché, Thuy-Le Do,Thi-Bao-Hoa Do, Thi-Yen Do, Maxime Haure, Phu-Ha Ho, Anil Kumar Anal, Van-Viet-Man Le, Wen-Jun Li, Hélène Licandro, Da Lorn, Mai-Huong Ly-Chatain, Sokny Ly, Warapa Mahakarnchanakul, Dinh-Vuong Mai, Hasika Mith, Dzung- Hoang Nguyen, Thi-Kim-Chi Nguyen, Thi-Minh-Tu Nguyen, Thi- Thanh-Thuy Nguyen, Viet-Anh Nguyen, Hai-Vu Pham, Tuan-Anh Pham, Thanh-Tam Phan, Reasmey Tan, Tien-Nam Tien, Thierry Tran, Sophal Try, Quyet-Tien Phi, Dominique Valentin, Van-Quoc- Bao Vo, Kitiya Vongkamjan, Duc-Chien Vu, Nguyen-Thanh Vu, Son Chu-Ky (2018), “Prospects for food fermentation in South-East Asia, topics from the Tropical Fermentation and Biotechnology Network at the end of the AsiFood Erasmus+ project”, Frontiers in Microbiology, 9:2278.,doi: 10.3389/fmicb.2018.02278; (SCIE, IF 4.01) [2] Tien Nam Tien, Nguyen Chinh Nghia, Pham Tuan Anh, Chu Ky Son (2018), “Application of vacuum to improve efficiency of non-cook process at very high gravity for ethanol production”, in National Biotechology Conference, pp. 417–422. [3] (2021) Quyết định chấp nhận đơn hợp lệ. Cục sở hữu trí tuệ - Bộ Khoa học và Công nghệ, Số 3706w/QĐ-SHTT, ngày 06 tháng 05 năm 2021. Số đơn: 1-2021-01723, ngày nộp 31/03/2021. Chủ đơn: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội (VN). Tên sáng chế: Hệ thống tích hợp lên men và chưng cất đa năng. Tác giả: Chu Kỳ Sơn, Tiền Tiến Nam, Nguyễn Tiến Thành, Nguyễn Chính Nghĩa, Nguyễn Tiến Cường, Phạm Tuấn Anh, Phạm Ngọc Hưng, Nguyễn Thị Hoài Đức. [4] Tien Nam Tien, Tien Cuong Nguyen, Chinh Nghia Nguyen, Tien Thanh Nguyen, Tuan Anh Pham, Ngoc Hung Pham, Son Chu-Ky (2022), “Protease increases ethanol yield and decreases fermentation time in no-cook process during very-high-gravity ethanol production from rice”, Process Biochem., vol. 117, March, pp. 10-18. (SCIE, IF 4.78) [5] Tiền Tiến Nam, Nguyễn Tiến Cường, Nguyễn Chính Nghĩa, Phạm Tuấn Anh, Chu Kỳ Sơn (2023), “Nghiên cứu ảnh hưởng của nguyên liệu gạo, nấm men và enzyme đường hóa đến hiệu suất lên men trong quy trình sản xuất cồn không gia nhiệt ở nồng độ chất khô cao”, Tạp chí Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, Vol.7, pp.46–56.